Сравнение методов фрагментного анализа и ПЦР-электрофореза для обнаружения мутаций FLT3‑ITD у пациентов с острым миелоидным лейкозом

Введение. Наличие мутаций FLT3-ITD у пациентов с острым миелоидным лейкозом служит маркером плохого прогноза, который включен в перечень для стратификации риска ELN 2017 г. Основным критерием для разделения пациентов на группы по прогнозируемым исходам стало аллельное соотношение (allelic ratio, AR) с границей 0,5: показатель AR <0,5 считается низким, ≥0,5 – высоким. при этом если важность определения AR не вызывает сомнения, то значение информации о длине повтора и локализации все еще остается спорным. Распространены 2 подхода к скринингу FLT3-ITD. первый – более доступный и дешевый метод полимеразной цепной реакции (пЦР) с электрофоретической детекцией, второй – более дорогостоящий и требующий наличия специального оборудования метод фрагментного анализа, позволяющий не только обнаружить мутацию и определить длину повтора, но и провести количественную оценку, т. е. рассчитать AR.
Цель исследования – сравнить методы фрагментного анализа и пЦР-электрофореза при поиске мутаций FLT3-ITD в образцах ДНК от пациентов с диагнозом острого миелоидного лейкоза.
Материалы и методы. За период 2020–2022 гг. методами фрагментного анализа и пЦР-электрофореза были проанализированы образцы крови и/или костного мозга от 45 пациентов с подтвержденным диагнозом острого миелоидного лейкоза, получавших лечение в Краевой клинической больнице г. Красноярска. подтверждение и идентификацию мутаций FLT3-ITD проводили секвенированием по Сэнгеру.
Результаты. Среди 45 пациентов оба метода позволили выявить мутации FLT3-ITD у 11 (24,45 %) пациентов. по результатам фрагментного анализа медиана длины повтора составила 42,70 (26,01–99,84) пары оснований, AR – 0,532 (0,027– 3,328), уровень аллельной нагрузки (allelic frequency, Af) – 34,71 (2,67–76,90) %. В 1 образце выявлено 3 разных ITd. Секвенирование по Сэнгеру позволило идентифицировать мутации у 9 из 11 пациентов.
Заключение. фрагментный анализ и пЦР-электрофорез показали сходные результаты при оценке образцов с разной длиной ITd и разным AR. Можно предполагать, что в случае небольшого размера ITd и низких значений AR и Af при использовании пЦР-электрофореза мутантный аллель не будет визуализироваться, что может привести к получению ложноотрицательного результата. Недостатком использования метода пЦР-электрофореза является также то, что без применения специальных программ, позволяющих определить размер и интенсивность свечения полосы, соответствующей мутантному аллелю, нельзя определить значение AR, что важно для стратификации риска острого миелоидного лейкоза. Таким образом, для обнаружения FLT3-ITD мы рекомендуем использовать метод фрагментного анализа.

1. Sakaguchi M., Nakajima N., Yamaguchi H. et al. The sensitivity of the FLT3­ITD detection method is an important consideration when diagnosing acute myeloid leukemia. Leuk Res Rep 2020;13:100198. DOI: 10.1016/j.lrr.2020.100198

2. Grimwade D., Ivey A., Huntly B.J. Molecular landscape of acute myeloid leukemia in younger adults and its clinical relevance. Blood 2016;127(1):29–41. DOI: 10.1182/blood­201507­604496

3. Mead A.J., Linch D.C., Hills R.K. et al. FLT3 tyrosine kinase domain mutations are biologically distinct from and have a significantly more favorable prognosis than FLT3 internal tandem duplications in patients with acute myeloid leukemia. Blood 2007;110(4):1262–70. DOI: 10.1182/blood­2006­04­015826

4. Chang P., Kang M., Xiao A. et al. FLT3 mutation incidence and timing of origin in a population case series of pediatric leukemia. BMC Cancer 2010;10:513. DOI: 10.1186/1471­2407­10­513

5. Schnittger S., Bacher U., Haferlach C. et al. Diversity of the juxtamembrane and TKD1 mutations (exons 13–15) in the FLT3 gene with regards to mutant load, sequence, length, localization, and correlation with biological data. Genes Chromosomes Cancer 2012;(10):910–24. DOI: 10.1002/gcc.21975

6. Meshinchi S., Stirewalt D.L., Alonzo T.A. et al. Structural and numerical variation of FLT3/ITD in pediatric AML. Blood 2008;111(10):4930–3. DOI: 10.1182/blood­2008­01­117770

7. Breitenbuecher F., Schnittger S., Grundler R. et al Identification of a novel type of ITD mutations located in nonjuxtamembrane domains of the FLT3 tyrosine kinase receptor. Blood 2009;113(17):4074–7. DOI: 10.1182/blood­2007­11­125476

8. Kayser S., Schlenk R.F., Londono M.C. et al. Insertion of FLT3 internal tandem duplication in the tyrosine kinase domain­1 is associated with resistance to chemotherapy and inferior outcome. Blood 2009;114(12):2386–92. DOI: 10.1182/blood­200903­209999

9. Gale R.E., Green C., Allen C. et al. Linch; on behalf of the Medical Research Council Adult Leukaemia Working Party, The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number, size, and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia. Blood 2008;111(5):2776–84. DOI: 10.1182/blood­2007­08­109090

10. Liu S.B., Dong H.J., Bao X.B. et al. Impact of FLT3­ITD length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica 2019;104(1):e9–12. DOI: 10.3324/haematol.2018.191809

11. Stirewalt D.L., Kopecky K.J., Meshinchi S. et al. Size of FLT3 internal tandem duplication has prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia. Blood 2006;107(9):3724–6. DOI: 10.1182/blood­2005­08­3453

12. Levis M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013? Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2013;2013:220–6. DOI: 10.1182/asheducation­2013. 1.220

13. Döhner H., Estey E., Grimwade D. et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017;129(4):424–47. DOI: 10.1182/blood­2016­08­733196

14. Shires K., Shankland I., Gerdener T. et al. FLT3 ITD detection: a closer look at the options. Med Technol SA 2011;25:39–46.

15. Tan A.Y., Westerman D.A., Carney D.A. et al. Detection of NPM1 exon 12 mutations and FLT3 – internal tandem duplications by high resolution melting analysis in normal karyotype acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol 2008;1:10. DOI: 10.1186/1756­8722­1­10

16. Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C. et al. COSMIC: the Catalogue of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research 2019;47(D1):D941–7. DOI: 10.1093/nar/gky1015

17. Griffith J., Black J., Faerman C. et al. The structural basis for autoinhibition of FLT3 by the juxtamembrane domain. Mol Cell 2004;13(2):169–78. DOI: 10.1016/s1097­2765(03)00505­7

18. Mills K.I., Gilkes A.F., Walsh V. et al. Rapid and sensitive detection of internal tandem duplication and activating loop mutations of FLT3. Br J Haematol 2005;130(2):203–8. DOI: 10.1111/j.1365­2141.2005.05589.x