Использование гетеродуплексного анализа для скринингового выявления соматических мутаций в экзоне 9 гена CALR у пациентов с Ph-миелопролиферативными новообразованиями

Введение. В соответствии с клиническими рекомендациями Всемирной организации здравоохранения анализ соматических мутаций в гене CALR, как и мутаций в генах JAK2 и MPL, включен в перечень критериев диагностики Ph-миелопролиферативных новообразований.

В гене CALR выявлено более 50 различных вариантов мутаций, среди которых наиболее распространенными являются делеция 52 (c.1092_1143del) и вставка 5 пар оснований (c.1154_1155insTTGTC) (88 %). Оставшиеся 12 % включают другие варианты делеций/вставок или их комбинаций, которые либо уникальны, либо обнаружены у небольшого числа пациентов.

Удобнее всего для выявления одновременно всех возможных вариантов мутаций CALR использовать методы секвенирования. Также актуально предварительное проведение дешевого скринингового теста, позволяющего выявить любые мутации в анализируемом фрагменте ДНК. Таким методом может стать гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ).

Цель работы – разработать, клинически апробировать и продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ для выявления мутаций в экзоне 9 гена CALR в качестве скринингового теста.

Материалы и методы. Для проведения скринингового исследования соматических мутаций в гене CALR методом гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ использовали образцы ДНК от 13 пациентов с различными фенотипическими вариантами Ph-миелопролиферативных новообразований и предварительно выявленными мутациями CALR. Для наиболее распространенных вариантов мутаций CALR (c.1092_1143del и c.1154_1155insTTGTC) был проанализирован порог определения доли мутантного аллеля. Нуклеотидную последовательность фрагмента экзона 9 гена CALR определяли с помощью cеквенирования по Сэнгеру. Также для оценки уровня аллельной нагрузки все 13 образцов были проанализированы с помощью метода пиросеквенирования.

Результаты. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволил выявить мутации в экзоне 9 гена CALR у всех 13 пациентов. Порог определения доли мутантного аллеля для мутации c.1154_1155insTTGTC составил от 6,25 % аллельной нагрузки, для мутации c.1092_1143del – от 3,13 %.

Заключение. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ подходит для скрининга любых вариантов делеций/вставок или их комбинаций в гене CALR. По наличию гетеродуплексов можно заключить о наличии мутации, даже если мутантный продукт не визуализируется в геле (в случае небольших мутаций).

1. Меликян А.Л., Суборцева И.Н. Биология миелопролиферативных новообразований. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика 2016;9(3):314–25.

2. Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005;365(9464): 1054–61. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)71142-9.

3. Scott L.M., Tong W., Levine R.L. et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N Engl J Med 2007;356(5):459–68. DOI: 10.1056/NEJMoa065202.

4. Pikman Y., Lee B.H., Mercher T. et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med 2006;3(7):e270. DOI: 10.1371/journal.pmed.0030270.

5. Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009;114(5):937–51. DOI: 10.1182/blood-2009-03-209262.

6. Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S. et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2013;369(25):2379–90. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347.

7. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369(25):2391–405. DOI: 10.1056/NEJMoa1312542.

8. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391–405. DOI: 10.1182/blood-2016-03-643544.

9. Lippert E., Mansier O., Migeon M. et al. Clinical and biological characterization of patients with low (0.1–2 %) JAK2V617F allele burden at diagnosis. Haematologica 2014;99(7): 98–101. DOI: 10.3324/haematol.2014.107656.

10. Nussenzveig R.H., Pham H.T., Perkins S.L. et al. Increased frequency of coexisting JAK2 exon-12 or MPL exon-10 mutations in patients with low JAK2V617F allelic burden. Leuk Lymphoma 2015;57(6):1429–35. DOI: 10.3109/10428194.2015.1091932.

11. Chauveau A., Nibourel O., Tondeur S. et al. Absence of CALR mutations in JAK2-negative polycythemia. Haematologica 2017;102(1):e15–6. DOI: 10.3324/haematol.2016.154799.

12. Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П. и др. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ 2016;(5):33–43.

13. Субботина Т.Н., Харсекина А.Е., Дунаева Е.А. и др. Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба 2017;6(1):29–33.

14. Rozovski U., Verstovsek S., Manshouri T. et al. An accurate, simple prognostic model consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary myelofibrosis. Haematologica 2017;102(1):79–84. DOI: 10.3324/haematol.2016.149765.

15. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

16. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M. et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia 2014;28(7):1472–7. DOI: 10.1038/leu.2014.3.