Preview

Онкогематология

Расширенный поиск

Использование гетеродуплексного анализа для скринингового выявления соматических мутаций в экзоне 9 гена CALR у пациентов с Ph-миелопролиферативными новообразованиями

https://doi.org/10.17650/1818-8346-2021-16-2-48-55

Полный текст:

Аннотация

Введение. В соответствии с клиническими рекомендациями Всемирной организации здравоохранения анализ соматических мутаций в гене CALR, как и мутаций в генах JAK2 и MPL, включен в перечень критериев диагностики Ph-миелопролиферативных новообразований.

В гене CALR выявлено более 50 различных вариантов мутаций, среди которых наиболее распространенными являются делеция 52 (c.1092_1143del) и вставка 5 пар оснований (c.1154_1155insTTGTC) (88 %). Оставшиеся 12 % включают другие варианты делеций/вставок или их комбинаций, которые либо уникальны, либо обнаружены у небольшого числа пациентов.

Удобнее всего для выявления одновременно всех возможных вариантов мутаций CALR использовать методы секвенирования. Также актуально предварительное проведение дешевого скринингового теста, позволяющего выявить любые мутации в анализируемом фрагменте ДНК. Таким методом может стать гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ).

Цель работы – разработать, клинически апробировать и продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ для выявления мутаций в экзоне 9 гена CALR в качестве скринингового теста.

Материалы и методы. Для проведения скринингового исследования соматических мутаций в гене CALR методом гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ использовали образцы ДНК от 13 пациентов с различными фенотипическими вариантами Ph-миелопролиферативных новообразований и предварительно выявленными мутациями CALR. Для наиболее распространенных вариантов мутаций CALR (c.1092_1143del и c.1154_1155insTTGTC) был проанализирован порог определения доли мутантного аллеля. Нуклеотидную последовательность фрагмента экзона 9 гена CALR определяли с помощью cеквенирования по Сэнгеру. Также для оценки уровня аллельной нагрузки все 13 образцов были проанализированы с помощью метода пиросеквенирования.

Результаты. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволил выявить мутации в экзоне 9 гена CALR у всех 13 пациентов. Порог определения доли мутантного аллеля для мутации c.1154_1155insTTGTC составил от 6,25 % аллельной нагрузки, для мутации c.1092_1143del – от 3,13 %.

Заключение. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ подходит для скрининга любых вариантов делеций/вставок или их комбинаций в гене CALR. По наличию гетеродуплексов можно заключить о наличии мутации, даже если мутантный продукт не визуализируется в геле (в случае небольших мутаций).

Об авторах

Т. Н. Субботина
ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»; 2ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства России»
Россия

Татьяна Николаевна Субботина

660041 Красноярск, проспект Свободный, 79

660037 Красноярск, ул. Коломенская, 26



Д. В. Курочкин
ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»
Россия

660041 Красноярск, проспект Свободный, 79



И. Е. Маслюкова
ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»
Россия

660041 Красноярск, проспект Свободный, 79



А. С. Хазиева
КГБУЗ «Краевая клиническая больница»
Россия

660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3а



Е. В. Васильев
КГБУЗ «Краевая клиническая больница»
Россия

660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3а



М. А. Михалёв
КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница № 7»
Россия

660003 Красноярск, ул. Академика Павлова, 4, стр. 3



Е. А. Дунаева
ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора
Россия

111123 Москва, ул. Новогиреевская, 3а



К. О. Миронов
ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора
Россия

111123 Москва, ул. Новогиреевская, 3а



Список литературы

1. Меликян А.Л., Суборцева И.Н. Биология миелопролиферативных новообразований. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика 2016;9(3):314–25.

2. Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005;365(9464): 1054–61. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)71142-9.

3. Scott L.M., Tong W., Levine R.L. et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N Engl J Med 2007;356(5):459–68. DOI: 10.1056/NEJMoa065202.

4. Pikman Y., Lee B.H., Mercher T. et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med 2006;3(7):e270. DOI: 10.1371/journal.pmed.0030270.

5. Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009;114(5):937–51. DOI: 10.1182/blood-2009-03-209262.

6. Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S. et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2013;369(25):2379–90. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347.

7. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369(25):2391–405. DOI: 10.1056/NEJMoa1312542.

8. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391–405. DOI: 10.1182/blood-2016-03-643544.

9. Lippert E., Mansier O., Migeon M. et al. Clinical and biological characterization of patients with low (0.1–2 %) JAK2V617F allele burden at diagnosis. Haematologica 2014;99(7): 98–101. DOI: 10.3324/haematol.2014.107656.

10. Nussenzveig R.H., Pham H.T., Perkins S.L. et al. Increased frequency of coexisting JAK2 exon-12 or MPL exon-10 mutations in patients with low JAK2V617F allelic burden. Leuk Lymphoma 2015;57(6):1429–35. DOI: 10.3109/10428194.2015.1091932.

11. Chauveau A., Nibourel O., Tondeur S. et al. Absence of CALR mutations in JAK2-negative polycythemia. Haematologica 2017;102(1):e15–6. DOI: 10.3324/haematol.2016.154799.

12. Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П. и др. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ 2016;(5):33–43.

13. Субботина Т.Н., Харсекина А.Е., Дунаева Е.А. и др. Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба 2017;6(1):29–33.

14. Rozovski U., Verstovsek S., Manshouri T. et al. An accurate, simple prognostic model consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary myelofibrosis. Haematologica 2017;102(1):79–84. DOI: 10.3324/haematol.2016.149765.

15. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

16. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M. et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia 2014;28(7):1472–7. DOI: 10.1038/leu.2014.3.


Для цитирования:


Субботина Т.Н., Курочкин Д.В., Маслюкова И.Е., Хазиева А.С., Васильев Е.В., Михалёв М.А., Дунаева Е.А., Миронов К.О. Использование гетеродуплексного анализа для скринингового выявления соматических мутаций в экзоне 9 гена CALR у пациентов с Ph-миелопролиферативными новообразованиями. Онкогематология. 2021;16(2):48-55. https://doi.org/10.17650/1818-8346-2021-16-2-48-55

For citation:


Subbotina T.N., Kurochkin D.V., Maslyukova I.E., Khazieva A.S., Vasiliev E.V., Mikhalev M.A., Dunaeva E.A., Mironov K.O. Application of heteroduplex analysis for CALR mutation screening detection in patients with Ph-myeloproliferative neoplasms. Oncohematology. 2021;16(2):48-55. (In Russ.) https://doi.org/10.17650/1818-8346-2021-16-2-48-55

Просмотров: 48


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1818-8346 (Print)
ISSN 2413-4023 (Online)