Сравнительные методологические исследования включения L-аспарагиназы в эритроциты

Введение. L-аспарагиназа широко используется в терапии острого лимфобластного лейкоза у детей и взрослых, но применение препарата ограничено из-за широкого спектра побочных эффектов и анафилактических реакций. Для решения этих проблем в качестве лекарственной формы может быть использована L-аспарагиназа, загруженная в эритроциты. При этом фермент защищен эритроцитарной мембраной от иммунной системы и протеаз плазмы, но продолжает работать внутри клетки, так как ее мембрана проницаема для аспарагина. Это увеличивает время полувыведения препарата и снижает анафилактические реакции. Включить L-аспарагиназу в эритроциты можно различными осмотическими методами. Каждый из них характеризуется количеством включенного фермента, долей выживших клеток, а также показателями качества загруженных лекарством эритроцитов. Для применения данной лекарственной формы в клинике ключевую роль играет также возможность обеспечить стерильность препарата.

Цель работы – сравнить 3 осмотических метода включения L-аспарагиназы в эритроциты (гипоосмотический лизис, диализ и проточный диализ) с целью выбора наиболее перспективного метода для применения в клинике.

Материалы и методы. Суспензию эритроцитов здоровых доноров (гематокрит 60–70 %) смешивали с L-аспарагиназой из E. сoli и подвергали в гипоосмотических условиях обратимому лизису, диализу в диализных мешках или проточному диализу с использованием педиатрических диализаторов. После процедуры эритроциты приводили к исходной осмоляльности добавлением гипертонического раствора и инкубировали 30 мин при температуре 37 °С, а затем отмывали в изотоничном фосфатно-солевом буфере с рН 7,4. В суспензиях эритроцитов до и после процедуры включения фермента измеряли объем, гематокрит и активность L-аспарагиназы, а также гематологические показатели и осмотическую резистентность клеток.

Результаты. Выбрана оптимальная осмоляльность гипотонического буфера для включения фермента, которая составила 90–110 мОсм/кг. Выходы инкапсуляции были равны 4,2 ± 2,0; 6,0 ± 2,3 и 16,2 ± 2,2 % для методов гипотонического лизиса, диализа и проточного диализа соответственно. Гематологические индексы полученных эритроцитов-носителей отличались от соответствующих показателей исходных эритроцитов, но не различались существенно для разных методов включения.

1. Verma N., Kumar K., Kaur G. et al. L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. Crit Rev Biotechnol 2007;27(1):45–62. DOI: 10.1080/07388550601173926. PMID: 17364689.

2. van den Berg Н. Asparaginase revisited. Leuk Lymphoma 2011;52(2):168–78. DOI: 10.3109/10428194.2010.537796. PMID: 21281233.

3. Müller H.J., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit Rev Oncol Hematol 1998;28(2):97–113. DOI: 10.1016/S1040-8428(98)00015-8. PMID: 9768345.

4. Graham M.L. Pegaspargase: a review of clinical studies. Adv Drug Del Rev 2003;55(10):1293–302. DOI: 10.1016/S0169-409X(03)00110-8. PMID: 14499708.

5. Alpar H.O., Lewis D.A. Therapeutic efficacy of asparaginase encapsulated in intact erythrocytes. Biochem Pharmacol 1985;34(2):257–61. DOI: 10.1016/0006-2952(85)90133-9. PMID: 3966927.

6. Kwon Y.M., Chung H.S., Moon C. et al. L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). J Control Release 2009;139(3):182–9. DOI: 10.1016/j.jconrel.2009.06.027. PMID: 19577600.

7. Updike S.J., Wakamiya R.T. Infusion of red blood cell-loaded asparaginase in monkey. J Lab Clin Med 1983;101(5):679–91. PMID: 6187874.

8. Naqi A., DeLoach J.R., Andrews K. et al. Determination of parameters for enzyme therapy using L-asparaginase entrapped in canine erythrocytes. Biotechnol Appl Biochem 1988;10(4):365–72. DOI: 10.1111/j.1470-8744.1988.tb00026.x. PMID: 3219195.

9. De Loach J., Ihler G. A dialysis procedure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochim Biophys Acta 1977;496(1):136–45. DOI: 10.1016/0304-4165(77)90121-0. PMID: 836891.

10. Kravtzoff R., Ropars C., Laguerre M. et al. Erythrocytes as carriers for L-asparaginase. Methodological and mouse in vivo studies. J Pharm Pharmacol 1990;42(7):473–6. DOI: 10.1111/j.2042-7158.1990.tb06598.x. PMID: 1980286.

11. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Жаботинский А.М. и др. Проницаемость эритроцитов человека для аспарагина. Биохимия 1985;50(10):1733–7.

12. Sinauridze E.I., Vitvitsky V.M., Pichu- gin A.V. et al. A new chemotherapeutic agent: L-asparaginase entrapped in red blood cells. In: Magnani M., DeLoach J.R. (eds). The Use of Resealed Erythrocytes as Carriers and Bioreactors. Adv Exp Med Biol 1992;326:203–6. DOI: 10.1007/978-1-4615-3030-5_25.

13. Kravtzoff R., Desbois I., Lamagnere J.P., et al. Improved pharmacodynamics of Lasparaginase-loaded in human red blood cells. Eur J Clin Pharm 1996;49(6):465–70. PMID: 8706771.

14. Millán C.G., Marinero M.L., Castañeda A.Z. et al. Drug, enzyme and peptide delivery using erythrocytes as carriers. J Control Release 2004;95(1):27–49. DOI: 10.1016/j.jconrel.2003.11.018. PMID: 15013230.

15. Синауридзе Е.И. Способ получения эритроцитов, заполненных лекарственным веществом: авторское свидетельство СССР № 1469609, 1 декабря 1988 г.

16. Domenech C., Thomas X., Chabaud S. et al. L-asparaginase loaded red blood cells in refractory or relapsing acute lymphoblastic leukaemia in children and adults: results of the GRASPALL 2005-01 randomized trial. Br J Haematol 2011;153(1):58–65. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2011.08588.x. PMID: 21332712.

17. Hunault-Berger M., Leguay T., Huguet F. et al. A phase 2 study of L-asparaginase encapsulated in erythrocytes in elderly patients with Philadelphia chromosome negative acute lymphoblastic leukemia: The GRASPALL/GRAALL-SA2-2008 study. Am J Hematol 2015;90(9):811–8. DOI: 10.1002/ajh.24093. PMID: 26094614.

18. Lanvers C., Vieira Pinheiro J.P., Hempel G. et al. Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal Biochem 2002;309(1):117–26. DOI: 10.1016/S0003-2697(02)00232-4. PMID: 12381370.

19. Shcherbachenko I.M., Lisovskaya I.L., Tikhonov V.P. Oxidation-induced calcium-dependent dehydration of normal human red blood cells. Free Radical Res 2007;41(5): 536–45. DOI: 10.1080/10715760601161452. PMID: 17454136.

20. Martinov M.V., Plotnikov A.G., Vitvitsky V.M. et al. Deficiencies of glycolytic enzymes as a possible cause of hemolytic anemia. Biochim Biophys Acta 2000;1474(1):75–87. DOI: 10.1016/S0304-4165(99)00218-4. PMID: 10699493.