Оценка чувствительности методов скрининга мутаций в экзоне 12 гена JAK2, основанных на гетеродуплексном и HRM-анализах

Введение. В рамках диагностики истинной полицитемии одним из критериев постановки диагноза является наличие соматических мутаций в экзоне 12 гена JAK2, однако на сегодняшний день для анализа данных мутаций нет единого метода. Ранее нами были предложены 2 метода скрининга таких мутаций на основе гетеродуплексного и HRM-анализов (High Resolution Melt, метод детекции мутаций на основании анализа кривых плавления), являющихся относительно дешевыми и быстрыми по сравнению с секвенированием.

Цель исследования – определение чувствительности гетеродуплексного и HRM-анализов, применяемых в качестве методов скрининга соматических мутаций в экзоне 12 гена JAK2.

Материалы и методы. Для определения чувствительности использованы клонированные образцы ДНК от 6 пациентов с различными мутациями в экзоне 12 гена JAK2 и образец ДНК без мутации. Было выполнено разведение клонированных образцов в различных соотношениях, содержащих 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,13; 1,56 и 0,78 % мутантного образца. Далее был проведен гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ (полиакриламидном геле) и HRM-анализ.

Результаты. Порог чувствительности гетеродуплексного анализа составил 3,13–6,25 % мутантного аллеля в пробе, в зависимости от конкретной мутации, порог чувствительности HRM-анализа – 6,25–12,5 % мутантного аллеля.

Заключение. Гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ и HRM-анализ для выявления специфических для истинной полицитемии мутаций в экзоне 12 гена JAK2 позволяют повысить эффективность использования различных типов секвенирования и могут быть использованы как более простые и менее дорогостоящие методы предварительного скрининга указанных мутаций.

1. Bose P., Verstovsek S. Updates in the management of polycythemia vera and essential thrombocythemia. Ther Adv Hematol 2019;10:2040620719870052. DOI: 10.1177/2040620719870052

2. Maddali M., Kulkarni U.P., Ravindra N. et al. JAK2 exon 12 mutations in cases with JAK2V617F-negative polycythemia vera and primary myelofibrosis. Ann Hematol 2020;99(5):983–9. DOI: 10.1007/s00277-020-04004-7

3. Scott L.M. The JAK2 exon 12 mutations: a comprehensive review. Am J Hematol 2011;86(8):668–76. DOI:10.1002/ajh.22063

4. Tondeur S., Paul F., Riou J. et al. Long-term follow-up of JAK2 exon 12 polycythemia vera: a French Intergroup of Myeloproliferative Neoplasms (FIM) study. Leukemia 2021;35(3):871–5. DOI:10.1038/s41375-020-0991-x

5. Silvennoinen O., Hubbard S.R. Molecular insights into regulation of JAK2 in myeloproliferative neoplasms. Blood 2015;125(22):3388– 92. DOI: 10.1182/blood-2015-01-621110

6. Субботина Т.Н., Харсекина А.Е., Дунаева Е.А. и др. Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба 2017;6(1):29–33. DOI: 10.17116/labs20176129-33

7. Kurochkin D., Maslyukova I., Subbotina, T. et al. P1056: screening of JAK2 exon 12 somatic mutations by high-resolution melting curve analysis. HemaSphere 2022;6:946–7. DOI: 10.1097/01.HS9.0000847092.01448.ed

8. Cубботина Т.Н., Дунаева Е.А., Миронов К.О. и др. Использование метода пиросеквенирования для выявления и количественной оценки аллельной нагрузки мутаций в 12-м экзоне гена JAK2. Гематология и трансфузиология 2016;61(4):196–200. DOI: 10.18821/0234-5730-2016-61-4-196-200

9. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

10. Jones A.V., Cross N.C., White H.E. et al. Rapid identification of JAK2 exon 12 mutations using high resolution melting analysis. Haematologica 2008;93(10):1560–4. DOI: 10.3324/haematol.12883

11. Pietra D., Li S., Brisci A. et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood 2008;111(3):1686–9. DOI: 10.1182/blood-2007-07-101576

12. Furtado L.V., Weigelin H.C., Elenitoba-Johnson K.S. et al. A multiplexed fragment analysis-based assay for detection of JAK2 exon 12 mutations. J Mol Diagn 2013;15(5):592–9. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2013.04.006