Background. According to WHO guidelines, one of the criteria for diagnosis of polycythemia vera is the presence of somatic mutations in exon 12 of the JAK2 gene, but to date there is no universally accepted simple method to analyze these mutations. We have previously proposed two methods for screening such mutations based on heteroduplex and HRM (High Resolution Melt) assays, which are relatively cheap and fast compared to sequencing.
Aim. To analyze the sensitivity of these screening methods.
Materials and methods. The study used cloned DNA samples from 6 patients with various mutations in exon 12 of the JAK2 gene that we had previously identified, as well as a clone of the corresponding wild-type DNA segment. Dilution of the cloned mutant samples with wild-type clones was performed to obtain samples with different levels of allele burden: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 and 0.78 %. Heteroduplex analysis followed by PAGE (polyacrylamide gel) and HRM analysis was then performed with the diluted samples.
Results. The sensitivity threshold of the heteroduplex analysis was found to be between 3.13–6.25 % allele burdens depending on the specific mutation, the sensitivity threshold of the HRM assay was 6.25–12.5 % similarly.
Conclusion. Our proposed methods of heteroduplex analysis followed by PAGE and HRM-analysis for the detection of polycythemia vera-specific mutations in exon 12 of the JAK2 gene allow increasing the efficiency of using different types of sequencing and can be used as simpler and less expensive methods of preliminary screening of these mutations.
Введение. В рамках диагностики истинной полицитемии одним из критериев постановки диагноза является наличие соматических мутаций в экзоне 12 гена JAK2, однако на сегодняшний день для анализа данных мутаций нет единого метода. Ранее нами были предложены 2 метода скрининга таких мутаций на основе гетеродуплексного и HRM-анализов (High Resolution Melt, метод детекции мутаций на основании анализа кривых плавления), являющихся относительно дешевыми и быстрыми по сравнению с секвенированием.
Цель исследования – определение чувствительности гетеродуплексного и HRM-анализов, применяемых в качестве методов скрининга соматических мутаций в экзоне 12 гена JAK2.
Материалы и методы. Для определения чувствительности использованы клонированные образцы ДНК от 6 пациентов с различными мутациями в экзоне 12 гена JAK2 и образец ДНК без мутации. Было выполнено разведение клонированных образцов в различных соотношениях, содержащих 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,13; 1,56 и 0,78 % мутантного образца. Далее был проведен гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ (полиакриламидном геле) и HRM-анализ.
Результаты. Порог чувствительности гетеродуплексного анализа составил 3,13–6,25 % мутантного аллеля в пробе, в зависимости от конкретной мутации, порог чувствительности HRM-анализа – 6,25–12,5 % мутантного аллеля.
Заключение. Гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ и HRM-анализ для выявления специфических для истинной полицитемии мутаций в экзоне 12 гена JAK2 позволяют повысить эффективность использования различных типов секвенирования и могут быть использованы как более простые и менее дорогостоящие методы предварительного скрининга указанных мутаций.