OncohematologyOncohematologyОнкогематология1818-83462413-4023Publishing House ABV Press47410.17650/1818-8346-2021-16-2-48-55BASIC RESEARCHФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕApplication of heteroduplex analysis for CALR mutation screening detection in patients with Ph-myeloproliferative neoplasmsИспользование гетеродуплексного анализа для скринингового выявления соматических мутаций в экзоне 9 гена CALR у пациентов с Ph-миелопролиферативными новообразованиямиhttps://orcid.org/0000-0001-7790-5033SubbotinaT. N.СубботинаТ. Н.
Russian Federation

Tat’yana Nikolaevna Subbotina

79 Svobodnyy Prospekt, Krasnoyarsk 660041

26 Kolomenskaya St., Krasnoyarsk 660037

Татьяна Николаевна Субботина

660041 Красноярск, проспект Свободный, 79

660037 Красноярск, ул. Коломенская, 26

stn.25@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1063-7702KurochkinD. V.КурочкинД. В.
Russian Federation

79 Svobodnyy Prospekt, Krasnoyarsk 660041

660041 Красноярск, проспект Свободный, 79

https://orcid.org/0000-0003-1323-2612MaslyukovaI. E.МаслюковаИ. Е.
Russian Federation

79 Svobodnyy Prospekt, Krasnoyarsk 660041

660041 Красноярск, проспект Свободный, 79

https://orcid.org/0000-0001-7525-6981KhazievaA. S.ХазиеваА. С.
Russian Federation

3а Partizana Zheleznyaka St., Krasnoyarsk 660022

660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3а

https://orcid.org/0000-0003-3780-3758VasilievE. V.ВасильевЕ. В.
Russian Federation

3а Partizana Zheleznyaka St., Krasnoyarsk 660022

660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, 3а

https://orcid.org/0000-0003-3769-3405MikhalevM. A.МихалёвМ. А.
Russian Federation

Build. 3, 4 Akademika Pavlova St., Krasnoyarsk 660003

660003 Красноярск, ул. Академика Павлова, 4, стр. 3

https://orcid.org/0000-0002-4477-8506DunaevaE. A.ДунаеваЕ. А.
Russian Federation

3a Novogireevskaya St., Moscow 111123

111123 Москва, ул. Новогиреевская, 3а

https://orcid.org/0000-0001-8207-9215MironovK. O.МироновК. О.
Russian Federation

3a Novogireevskaya St., Moscow 111123

111123 Москва, ул. Новогиреевская, 3а

Siberian Federal UniversityФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»Federal Siberian Research and Clinical Center of the Federal Medical and Biological Agency of Russia2ФГБУ «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства России»Regional Clinical HospitalКГБУЗ «Краевая клиническая больница»City Clinical Hospital No. 7КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница № 7»Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Customer Rights Protection and Human WellbeingФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора0706202116248550406202104062021https://oncohematology.abvpress.ru/ongm/article/view/474

Background. In accordance with the World health organization clinical guidelines, the analysis of somatic mutations in the CALR gene, as well as mutations in the JAK2 and MPL genes, are included in the list of criteria for the Ph-myeloproliferative neoplasms diagnosis.

More than 50 different mutation variants have been found in the CALR gene, among which the most frequent are a 52 bp deletion (c.1092_1143del), also called type 1, and a 5 bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), also called type 2 (88 %).

The remaining 12 % are other type less frequent indels or combinations thereof.

It is most convenient to use sequencing methods to identify all possible variants of CALR mutations. It is also important to develop inexpensive screening test that can detect any mutations in the analyzed DNA fragment of CALR gene. This method can be heteroduplex analysis followed by electrophoresis on polyacrylamide gel (PAGE).

The objective: to develop and demonstrate the feasibility of using heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE for the CALR exon 9 mutations detection as the screening test. Materials and methods. DNA samples of 13 CALR-positive patients with different phenotypic variants of Ph-myeloproliferative neoplasms were screened by heteroduplex analysis. For the most common variants of CALR mutations (c.1092_1143del and c.1154_1155insTTGTC), a threshold determination of the mutant allele presence was analyzed.

Nucleotide sequence of exon 9 fragment was determined using Sanger sequencing. Also, all 13 samples were analyzed using the pyrosequencing method to assess the allelic burden level.

Results. Heteroduplex analysis revealed mutations in exon 9 of the CALR gene in all 13 patients. The threshold determinations of the method in the case of the c.1154_1155insTTGTC and c.1092_1143del analysis are 6.25 % and 3.13 % of the mutant allele presence in the patient sample, respectively.

Conclusion. The proposed variant of the heteroduplex analysis with separation of the PCR product by electrophoresis on non-denaturing PAGE can be recommended for use as the preliminary screening test which is carried out before the confirming sequencing methods for the different indels (or combinations thereof) CALR mutations determine.

The presence of heteroduplexes indicates the presence of a mutation, even if the mutant product is not visualized (in case of small mutations).

Введение. В соответствии с клиническими рекомендациями Всемирной организации здравоохранения анализ соматических мутаций в гене CALR, как и мутаций в генах JAK2 и MPL, включен в перечень критериев диагностики Ph-миелопролиферативных новообразований.

В гене CALR выявлено более 50 различных вариантов мутаций, среди которых наиболее распространенными являются делеция 52 (c.1092_1143del) и вставка 5 пар оснований (c.1154_1155insTTGTC) (88 %). Оставшиеся 12 % включают другие варианты делеций/вставок или их комбинаций, которые либо уникальны, либо обнаружены у небольшого числа пациентов.

Удобнее всего для выявления одновременно всех возможных вариантов мутаций CALR использовать методы секвенирования. Также актуально предварительное проведение дешевого скринингового теста, позволяющего выявить любые мутации в анализируемом фрагменте ДНК. Таким методом может стать гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ).

Цель работы – разработать, клинически апробировать и продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ для выявления мутаций в экзоне 9 гена CALR в качестве скринингового теста.

Материалы и методы. Для проведения скринингового исследования соматических мутаций в гене CALR методом гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ использовали образцы ДНК от 13 пациентов с различными фенотипическими вариантами Ph-миелопролиферативных новообразований и предварительно выявленными мутациями CALR. Для наиболее распространенных вариантов мутаций CALR (c.1092_1143del и c.1154_1155insTTGTC) был проанализирован порог определения доли мутантного аллеля. Нуклеотидную последовательность фрагмента экзона 9 гена CALR определяли с помощью cеквенирования по Сэнгеру. Также для оценки уровня аллельной нагрузки все 13 образцов были проанализированы с помощью метода пиросеквенирования.

Результаты. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволил выявить мутации в экзоне 9 гена CALR у всех 13 пациентов. Порог определения доли мутантного аллеля для мутации c.1154_1155insTTGTC составил от 6,25 % аллельной нагрузки, для мутации c.1092_1143del – от 3,13 %.

Заключение. Метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ подходит для скрининга любых вариантов делеций/вставок или их комбинаций в гене CALR. По наличию гетеродуплексов можно заключить о наличии мутации, даже если мутантный продукт не визуализируется в геле (в случае небольших мутаций).

Ph-myeloproliferative neoplasmCALRheteroduplex analysisSanger sequencingPh-миелопролиферативное новообразованиеген CALRгетеродуплексный анализсеквенирование по СэнгеруMelikyan A.L., Subortseva I.N. Biology of myeloproliferative malignancies. Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical Oncohematology 2016;9(3):314–25. (In Russ.). DOI: 10.21320/2500-2139-2016-9-3-314-325.Меликян А.Л., Суборцева И.Н. Биология миелопролиферативных новообразований. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика 2016;9(3):314–25.Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005;365(9464): 1054–61. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)71142-9.Scott L.M., Tong W., Levine R.L. et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N Engl J Med 2007;356(5):459–68. DOI: 10.1056/NEJMoa065202.Pikman Y., Lee B.H., Mercher T. et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med 2006;3(7):e270. DOI: 10.1371/journal.pmed.0030270.Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009;114(5):937–51. DOI: 10.1182/blood-2009-03-209262.Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S. et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med 2013;369(25):2379–90. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347.Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369(25):2391–405. DOI: 10.1056/NEJMoa1312542.Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391–405. DOI: 10.1182/blood-2016-03-643544.Lippert E., Mansier O., Migeon M. et al. Clinical and biological characterization of patients with low (0.1–2 %) JAK2V617F allele burden at diagnosis. Haematologica 2014;99(7): 98–101. DOI: 10.3324/haematol.2014.107656.Nussenzveig R.H., Pham H.T., Perkins S.L. et al. Increased frequency of coexisting JAK2 exon-12 or MPL exon-10 mutations in patients with low JAK2V617F allelic burden. Leuk Lymphoma 2015;57(6):1429–35. DOI: 10.3109/10428194.2015.1091932.Chauveau A., Nibourel O., Tondeur S. et al. Absence of CALR mutations in JAK2-negative polycythemia. Haematologica 2017;102(1):e15–6. DOI: 10.3324/haematol.2016.154799.Mironov K.O., Dunaeva E.A., Dribnokhodova O.P. et al. Experience of using genetic analysis systems based on pyrosequencing technology. Spravochnik zaveduyushchego KDL = CDL Head Handbook 2016;(5):33‒43. (In Russ.).Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П. и др. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ 2016;(5):33–43.Subbotina T.N., Kharsekina A.E., Dunaeva E.A. et al. Heteroduplex analysis and pyrosequencing in the diagnostic algorithm of polycythemia vera associated with JAK2 exon 12 mutations. Laboratornaya sluzhba = Laboratory Service 2017;6(1):29–33. (In Russ.). DOI: 10.17116/labs20176129-33.Субботина Т.Н., Харсекина А.Е., Дунаева Е.А. и др. Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба 2017;6(1):29–33.Rozovski U., Verstovsek S., Manshouri T. et al. An accurate, simple prognostic model consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary myelofibrosis. Haematologica 2017;102(1):79–84. DOI: 10.3324/haematol.2016.149765.Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M. et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia 2014;28(7):1472–7. DOI: 10.1038/leu.2014.3.